【ASM Journals mBio】3D细胞案例 — Target 48 助力丝氨酸蛋白酶抑制剂抗新冠药物研发
新冠肺炎是一种复杂的疾病，从无症状或轻度到中度呼吸综合症，再到需住院治疗的重症，严重到可致命的严重急性呼吸综合症。目前已经确定了一些重症的风险因素，包括老年和男性，以及糖尿病、肥胖、高血压、心血管疾病和慢性肾脏疾病等并发症；但即使是年轻和其他健康的人也可能受到严重影响并死于感染，不同个体间SARS-CoV-2的易感性和疾病症状存在巨大差异，尚不清楚其原因，这表明个体的遗传变异可能会影响临床严重程度。所以，鉴别诱导SARS-CoV-2感染的宿主因子，既有助于我们理解病毒感染的机制，也有助于抗病毒药物的开发。
新文速递
瑞典优密欧大学临床微生物学团队近期研究中发现，通过转录组观察到蛋白酶抑制剂高差异性表达，或可通过抑制TMPRSS2，阻止病毒刺突蛋白剪切，从而阻断病毒入侵宿主细胞；文中进一步采用体外培养的人源的3D细胞模型，验证细胞内丝氨酸蛋白酶抑制剂可抑制SARS-CoV-2入侵宿主，且在患者体内可降低血液中病毒数量，通过Olink Target48 细胞因子Panel对免疫系统应答进一步进行研究，旨在深入理解新冠重症发病机制，并发现潜在的病人分层标志物。
研究者们采用从八个不同供体分离的原代支气管上皮细胞（HBEC）培养形成的人呼吸道上皮3D类组织。这些细胞培养21天，在气液界面（ALI）处分化以形成假复层的极性化上皮，顶层有含有功能齐全的分泌和纤毛细胞，底层有基底细胞。每个供体来源细胞构建HBEC-ALI模型分成两组：空白对照组和SARS-CoV-2感染组，并进行后续的系统研究和检测分析。
检测方法
方法一： 在不同时间点（24h、48h和72h）收集含有释放子代病毒的底部培养液和顶层分泌物，通过qPCR定量病毒和病毒载量来监测感染过程；
方法二：感染72小时后，在八个供体来源的HBEC-ALI培养孔中分别收集顶层和基底外侧细胞并进行RNA转录组测序，分为空白对照组和感染组；
方法三： 感染72小时后，在八个供体来源的HBEC-ALI培养孔中分别收集顶端和基底外侧腔室中的培养液，分为空白对照组和感染组，使用Olink Target 48细胞因子panel，进行细胞因子的表达浓度检测，包括绝对定量（pg/mL）和相对定量（NPX）数据；
方法四：对不同培养时间点（0h、48h和72h）的空白对照和感染组样本，分别收集HBEC-ALI培养孔中的顶层和基底外侧细胞，并进行单细胞RNA转录组测序分析。
细胞因子定量分析数据（方法三）与RNA转录组学数据（方法二/四）进行关联分析，研究者们观察到在易感组感染后的培养物中顶层和底层外侧室中CXCL10表达量大幅增加，但在不敏感组中未观察到该现象；在感染后的这些培养液中细胞因子表达的差异很小，但这些分泌型蛋白因子在底层外侧室中比顶层的变化大；除CXCL10外，易感组在底层外侧室中IL-33、IL-18、CXCL11和CSF2的表达升高，而不敏感组中的TGFA、FLT3GL、IL-15、MMP12、EGF、CCL2、CSF1表达略低。
通过多组学和Olink Target48细胞因子检测联用，发现来源自非易感患者培养的3D细胞模型中，丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达水平更高，且主要在基底细胞、纤毛细胞、棒状细胞和杯状细胞中表达，并确定其表达水平的变化是制约SARS-CoV-2感染的宿主因子。文章更深入理解了此类抑制剂的抗病毒作用机制，可通过抑制细胞丝氨酸蛋白酶TMPRSS2，阻止病毒刺突蛋白剪切，从而阻断TMPRSS2介导的病毒入侵目标宿组细胞途径，并发现了潜在细胞因子标志物或可区分易感/非易感患者人群。
1.Nature Reviews Molecular Cell Biology. Nat Rev Mol Cell Biol. ISSN 1471-0080
2.Serine Protease Inhibitors Restrict Host Susceptibility to SARSCoV-2 Infections. ASM Journals mBio. (2022) Vol. 13, No. 3.
