【Cell Host Microbe】Olink Flex｜牛津大学团队揭示呼吸道病毒促进肺炎球菌传播机制

研究简介

牛津大学和利物浦热带医学院研究人员在近期在国际期刊Cell Host Microbe上发表了一项研究：评估了581名健康成人在鼻内肺炎球菌感染前的上呼吸道病毒自然感染筛查与受控人类肺炎球菌感染的关系；研究发现，呼吸道合胞病毒（RSV）和鼻病毒的无症状感染显著增加了肺炎球菌的继发感染风险，且RSV对感染后9天内肺炎球菌的密度产生了显著影响；高水平的肺炎球菌定植密度与鼻部炎症及流鼻涕（而非咳嗽）的几率增加密切相关；因此，预防呼吸道病毒感染和控制肺炎球菌密度可能有助于降低肺炎球菌疾病的发生和细菌传播。

研究者使用受控的人类感染模型研究了特定呼吸道病毒与肺炎球菌携带易感性之间的关系。由于携带的起始时间是已知的，这允许确定病原体的顺序，从而确定细菌密度和宿主反应之间的因果关系。此外，研究者描述了在携带的早期和晚期细菌扩散的动力学，并提供了成人在携带肺炎球菌时也可以作为细菌传播宿主的首例证据。

研究解读

在2011年11月至2019年10月期间，英国利物浦热带医学院进行了实验性人类肺炎球菌感染研究，共有581名健康成年人参与。参与者年龄在18至55岁之间，他们通过鼻内途径接受了活的肺炎球菌6B型（BHN418菌株）的感染。在鼻内感染前（筛查访问）和感染后的几个时间点收集了鼻腔灌洗液样本。

随后，研究人员使用Olink Flex 定制细胞因子风暴试剂盒对鼻腔灌洗液中的人细胞因子和趋化因子进行定量。寡核苷酸标记的双抗体探针与目标蛋白高度特异性结合，然后采用Signature Q100微流控实时PCR扩增寡核苷酸序列，对得到的DNA序列进行定量检测。通过使用内部和外部质控对阈值循环数据进行质量控制和标准化处理，从而获得绝对定量pg/ml浓度值。

所有参与者在筛查访视时（肺炎球菌接触前4或5日）均接受了上呼吸道病毒检测。鼻/口咽样本单点分析表明，17%（99/ 581）的人在肺炎球菌接触试验前无症状地感染了呼吸道病毒。检测到的感染仅由单一病毒引起，其中鼻病毒（Rhinovirus，RH）最常见（7.6%），其次是季节性冠状病毒（Seasonal coronaviruses，hCoV，4%），而呼吸道合胞病毒（RSV-A/RSV-B）、副流感病毒（Parainfluenza viruses，PIVs）和腺病毒较少见。研究中，通过鼻腔灌洗液样本的纵向分析，在581名参与者中有291人（50%）检测到肺炎球菌定植。分析显示，无症状上呼吸道病例中，定植组与非定植组之间，呼吸道病毒的分布有差异。鼻病毒（RH）、呼吸道合胞病毒（RSV）和副流感病毒（PIV）在定植后更明显。

无症状上呼吸道感染期间人体上呼吸道的炎症特征

该研究通过测量鼻腔灌洗液样本中的多种细胞因子来评估与病毒感染相关的鼻部炎症水平，这些样本是在参与者接触肺炎球菌之前（筛选时）收集。研究将个体根据病毒感染类型（HCoV、RH或RSV）分为三组，并与未感染组（病毒阴性组）进行比较。鼻病毒（RH）感染：即使无症状，也会引起急性鼻部炎症反应，强烈诱导促炎介质（如肿瘤坏死因子α[TNF-a]、白介素6[IL-6]和IL-1b）、单核细胞趋化因子（如巨噬细胞炎症蛋白1a和1b[MIP-1a和MIP-1b]）以及多种抗病毒介质的显著增加，如I型、II型和III型干扰素（IFNs）、颗粒酶A、IP10和由干扰素γ诱导的单核细胞（MIG）。季节性冠状病毒（HCoV）感染：引起的鼻部炎症类型与RH感染相似，但测量到的细胞因子水平较低，表明整体炎症反应较弱。呼吸道合胞病毒（RSV）感染：炎症特征相对较轻，是三种上呼吸道感染中促炎性最低的，其特点是缺乏趋化因子的诱导和相对较弱的抗病毒反应。

尽管由于病毒类型和感染时间的不同而引入了差异，但有9种细胞因子（如粒细胞-单核细胞集落刺激因子[GM-CSF]、颗粒酶A、IFN-g、IL-2、IL-33、IL-4、IL-10、IL-6和TNF-a）被识别为在所有无症状病毒感染中普遍诱导的。此外，研究还根据实验性感染后的肺炎球菌携带结果对每组的炎症反应进行了分层和分析，以调查某些炎症介质是否与易感性有关。在研究的队列中，那些将成为定植者和那些定植中止的人在每个病毒组别中——单独或在合并的病毒感染组中——细胞因子水平没有差异。

热图显示了鼻腔灌洗液中多种细胞因子和趋化因子水平变化

研究者还通过在4个时间点（第2天、第6天、第16天和第22天），测量流鼻涕者和咳嗽者鼻粘膜液中多种细胞因子的水平来评估鼻腔炎症，并与非流鼻涕者在同一时间点测量的水平进行比较。鼻毛囊具有明显的促炎特征，其特征是生长因子、促炎细胞因子（IL-1b和TNF-a）和影响单核细胞和粒细胞迁移的趋化因子（如MIP-1a、MIP-1b和粒细胞- CSF [G-CSF]）的富集。在第2天（9种上调）、第6天和第16天（7种上调）观察到与非流鼻涕者组相比，鼻腔炎症反应的增加，但在刺激后的第22天没有观察到。另一方面，在实验诱导的肺炎球菌定植过程中，咳嗽者与非咳嗽者在任何时间点多种细胞因子水平都没有差异。

写在最后

通过研究探讨自然无症状的呼吸道病毒感染，如RH、RSV和PIV，对实验诱导的肺炎球菌定植的影响，研究团队发现这些病毒初次感染显著增加了肺炎球菌的携带率，其中RSV的影响最为显著。这不仅支持了流行病学和临床观察，而且强调了新近获得的携带事件可能增加疾病发展的风险，这可能是因为宿主尚未建立对病原体的免疫力。研究结果表明，预防呼吸道病毒感染和控制肺炎球菌的密度对于预防肺炎球菌疾病和阻断其传播至关重要。虽然现有的肺炎球菌结合疫苗已显著降低了侵袭性肺炎球菌病的病例，但它们对肺炎球菌的定植和密度的影响可能被低估。

该研究使用Olink Flex panel试剂盒对鼻腔灌洗液中的人细胞因子和趋化因子进行定量。Olink Flex panel通过创建定制的解决方案，以满足独特的炎症研究需求。仅需要1µl检测样本，在不影响数据质量的情况下，从将近200个预先优化的生物标志物库中，将5-30种生物标志物自由组合和匹配到同一个检测panel中。Olink Flex提供了一系列涵盖广泛研究领域的预先设计panel，这些panel由该领域的专家设计或与该领域的专家合作设计，涵盖促炎反应、炎症、免疫肿瘤、细胞因子风暴、衰老和Th1/Th2/Th17反应等。Olink Flex通过将丰富的预先优化的库中5-30个预先验证的生物标志物与业界领先的组合能力相结合，实现了有针对性的研究，同时保持了卓越的数据质量和最小的样本消耗。