【Blood Advances】细胞治疗｜Olink血浆蛋白组学助力CAR-T治疗中CRS机制研究与早期标志物发现
细胞因子释放综合症（Cytokine release syndrome, CRS）是一种致命的失控性全身炎症反应。在CD19 CAR-T细胞治疗B细胞恶性疾病的过程中，常导致CRS。其通常发生在治疗的第一周，表现为增加的促炎细胞因子症状，如发热、头痛和恶心。有些情况下可能会进展至低血压、低氧和多器官功能衰竭。预测CRS以及深入了解CRS的发生机制仍然是提高CAR-T细胞疗法效果的未满足需求。然而，除了已知与CRS相关的细胞因子组合外，目前对于CRS机制和早期预测的了解仍然十分有限。
图源:https://medicaltrend.org/
新文速递
密西根大学研究团队近期研究研究成果发表于国际期刊 Blood Advances杂志（IF 7.64）：文中研究团队采用Olink蛋白组学技术，对26名接受了CD19 CAR-T细胞治疗患者的血浆样本进行了纵向蛋白组学研究，旨在发现与CRS相关的新型蛋白标志物，以有助于在CAR-T细胞输注前评估CRS风险，或被用于更早地检测和强化治疗。
纵向蛋白组学研究采用了Olink Target 96 Cardiometabolic、CVD III、Immune Response、Inflammation和Neuro Exploratory五个Panel，对血浆样本中的453个蛋白质标志物进行了系统分析。血样在基线、CAR-T细胞输注当天以及住院期间的多个时间点进行采集（～2周）。通过差异表达分析和线性混合模型，确定了在CRS期间高表达的蛋白。
在26名患者中，21名发生了CRS反应。21名患者的最高CRS发生时（即患者经历CRS最高等级的第一天）与未发展CRS的5名患者的输注后样本相比，多个已知的CRS相关细胞因子表达上升，包括IFN-gamma、IL6、IL15和IL10。同时，作者还新发现了6种在最高CRS发生时发生显著上调的蛋白质，并且11种蛋白在此时显著下调。值得注意的是，本研究新发现的CD33蛋白是一个新型的CRS蛋白标志物，其丰度的增加程度与IFN-gamma和IL6相当。CD33在髓系细胞，尤其是中性粒细胞和单核细胞上表达，这些细胞通过细胞因子分泌与其他白细胞进行相互作用，可能是炎症的重要调节者。单核细胞表达细胞因子IL-1和IL-6，并已在动物模型中证明对CRS的发展至关重要。
为了确定CRS发生的预测性候选生物标志物，研究人员比较了CRS患者和未发生CRS患者的基线血浆蛋白质，发现11种蛋白在基线时呈现差异表达。其中，三种蛋白SERPINE1（PAI-1）、TNFSF11（RANKL）和PON3在基线时的差异丰度q值<0.1，被认为是预测CRS的候选生物标志物。此前已有报道，血清中的SERPINE1（PAI-1）在败血症、ARDS和COVID-19患者中表达水平升高，而本研究首次报道了SERPINE1（PAI-1）可作为CRS基线预测因子。值得注意的是，SERPINE1（PAI-1）还是内皮活化的标志物，这一生物学过程对CRS的发展也至关重要。有趣的是，在最高CRS发生时表达上升的CD33和其他五种蛋白，在CRS患者中的基线表达量也较高。
随后，作者评估了蛋白丰度在纵向动态中是否与后续CRS发展相关。采用线性混合模型分析法，发现43种蛋白在发展任何等级CRS和从未发展CRS的患者之间，在时间上呈现出差异性表达。43个差异蛋白中有22种在两组之间表现稳定，但绝对表达水平不同。其中7种与最高CRS发生时升高的蛋白相一致，而CD33在整个CRS发生期间的血浆中稳定升高。
与未经历CRS的患者相比，另外21种蛋白质在发展CRS的过程中表现出逐渐增加或减少的趋势，其中髓过氧化物酶蛋白（MPO）的显著性变化最高，p值最低。在经历CRS的患者组中，MPO在第0天表达较低，而在CRS发生时显著升高。MPO主要在中性粒细胞中特异性表达，是中性粒细胞嗜酸性颗粒的主要成分之一。中性粒细胞激活后，MPO释放，引发炎症增加，并对内皮和组织造成损害，可能与CRS的发展有关。此外，MPO对中性粒细胞外细胞陷阱（NETs）的释放至关重要，是NETosis的标志物。
通过纵向分析，研究发现其他显著差异表达的蛋白，包括另一种中性粒细胞蛋白DEFA1、中性粒细胞活化标志RETN，以及中性粒细胞粘附受体DPEP1。这些发现暗示中性粒细胞的激活，尤其是NETosis的过程，可能与CRS的发展相关。随后，作者使用ELISA检测中性粒细胞激活和NETosis的另外两个标志物，去鸟氨酸化组蛋白H3（CitH3）和循环钙卫蛋白。结果显示，在后来发展为CRS的患者中，CitH3和Calprotectin显著升高。在发展为1-2级或3-4级CRS的患者中，CitH3升高，而Calprotectin只在发展为3-4级CRS的患者中升高。
血浆中中性粒细胞相关蛋白质水平升高与CRS的发生和等级呈正相关，暗示中性粒细胞的失调和过度激活可能是CRS发生和风险的一个新机制。中性粒细胞激活和NETosis在之前的CAR-T细胞疗法相关CRS研究中尚未报道。若未能控制或降解NETs，它们可能作为损伤相关的分子模式，进而放大炎症。过度的NETosis在各种感染性和自身免疫性疾病中均促进炎症和组织损害。最近对COVID-19发病机制的研究表明，NETs通过促进IL-1β和IL-6等细胞因子的释放参与导致某些COVID-19患者呼吸衰竭的细胞因子风暴。高水平的calprotectin和中性粒细胞数量的增加与严重的COVID-19病例相关。本研究指出，CAR-T细胞输注前已经发生了NETosis相关信号，表明NETosis可能作为候选生物标志物具有预测价值，并可能在后续CRS的全身性炎症级联反应中发挥放大作用。
新型候选蛋白标志物在纵向血浆蛋白组学筛选中被发现，并成功识别出了基线、CRS发生前和CRS期间与CRS预测相关趋势。这些潜在标志物有望在CAR-T细胞输注前评估CRS风险，或被用于更早地检测和强化治疗。本研究结果对于深入了解和预测严重CRS以及可能的新治疗靶点具有重要意义。研究首次揭示了NETosis和中性粒细胞活性作为CRS发展的新机制，这是令人兴奋的发现。
值得注意的是，已经有FDA批准的药物可以抑制中性粒细胞激活或NETosis。如果这一假设得到验证，这些药物将有望用于临床试验中，成为预防CRS治疗方案的一部分。这为未来研究和治疗提供了潜在的新途径，为改善CAR-T细胞疗法的安全性和效果提供了新的方案。
1. Longitudinal plasma proteomics in CAR-T cell therapy patients implicates neutrophils and NETosis in the genesis of CRS, Blood Adv bloodadvances.2023010728.
如有需求Olink服务需求，欢迎咨询Olink认证服务商—中科普瑞
电话：021-58086128
邮箱：market@sinomics.com
