Olink技术白皮书｜蛋白标志物研究采用NPX相对定量的四个原因
绝对定量和相对定量是蛋白质组学研究中的两大定量方法，其有助于研究人员对生物体内蛋白质的丰度变化和功能特征进行深入探索。
绝对定量通常指利用已知蛋白质浓度的样本（或内标物质）生成标准曲线，从而推断出待测蛋白质的浓度（如pg/ul）。
相对定量则通过不同样本中蛋白质水平的相对信号差异，对不同条件下的蛋白质表达水平进行比较。相对定量也被称为“差异定量”，可在有或没有参比样本的情况下进行。
绝对定量与相对定量在疾病生物学研究，药物开发和精准医学中都有重要的应用。绝对定量一定优于相对定量吗？何时选择绝对定量，何时选择相对定量？Olink的产品提供的是绝对定量还是相对定量数据？
在Olink全新的白皮书，《一切都是相对的｜生物标志物发现使用相对性量OlinkTM NPX的四个原因》中，我们将一起探索绝对定量和相对定量的不同使用场景，找出最佳的定量模式。
白皮书内容
1. 明确定义的参考标准蛋白质数量有限
大多数情况下，标准曲线是采用在非原生、外源系统中表达的纯化蛋白质 "标准 "来绘制的。然而，并非所有蛋白质都能在体外表达或有效纯化，从而限制了可量化的蛋白质数量。
蛋白质折叠、翻译后修饰 (PTM) 和纯度在批次间的差异也导致明确定义的参考标准蛋白质数量有限。此外，在蛋白质组学领域，很少有绝对定量的参考标准蛋白质是根据世界卫生组织（WHO）等机构制定的严格指南生成的。这意味着，不同方法测得的同一种蛋白质的浓度可能会有所不同。
为了阐明公认的“绝对”定量分析的可变性，我们比较了使用不同供应商标准曲线的两种夹心ELISA。两者均使用同一组血浆样本（n=18）测量马 IGF-1 蛋白。然而，对于相同的样本，两种试剂盒测量的浓度相差约 100 倍。
用于生成标准曲线的蛋白质应显示出与检测样本相同的剂量-反应特征。虽然基于生物的标准基质可以解决基质效应问题，但它们可能含有内源性靶蛋白，从而影响准确定量。替代选择包括成本高昂的对照“替代”基质或需要长时间开发的分析物。无论如何，标准曲线的剂量-反应特性必须在开发过程中进行彻底测试，以确保线性。
3. 绝对定量通常会增加实验偏差的风险
与相对定量相比，绝对定量的蛋白质组工作流程通常需要更多步骤，如移液、细胞培养和标记。然而，随着样本处理步骤的增加，影响定量准确性的实验偏差的风险也会随之增加。
4. 多重蛋白质检测很难做到绝对定量
包括使用Olink 蛋白组学技术的研究在内的越来越多的生物标记物研究表明，多蛋白特征比单蛋白具有更高的鉴别力。这些研究凸显了生物标记物发现过程中多重蛋白质检测的重要性。然而，随着多重化程度的提高，绝对定量变得更加困难，因为必须为每种感兴趣的蛋白质制定标准参考或曲线。
多重蛋白质检测的"金标准"方法是自下而上的质谱法（MS），其中相对定量仍是最常用的定量方法。这是因为绝对定量的成本较高，标准曲线的优化需要大量时间，而且有些标准品很难获得。不完全的和可变的酶解也阻碍了基于 MS 方法的精确定量。最后，使用 "无标记 "质谱方法进行精确、稳健的绝对定量仍然是一项挑战，尤其是对于多重蛋白质检测而言，因为肽洗脱峰的色谱图需要对齐，必须在复杂样本和不同进样中确定合适的肽进行定量，而且仍然没有理想的均一化方法来消除系统性偏差。
NPX作为相对定量单位，与蛋白质浓度呈对数关系。在单次运行和板间均一化的情况下，NPX的相对差异可以更容易进行比较。且通常不需要额外的标准化步骤。Olink的绝对定量产品Target 48细胞因子和相对定量产品Explore分别得到的定量结果的比较表明，38种检出蛋白质的斯皮尔曼相关系数（rs）中位数为0.95。这表明两种产品得到的数据高度相关。数据还表明，在没有标准曲线的情况下，使用Olink技术进行相对定量可以准确计算出差异蛋白表达。
