【Eur Heart J】蛋白质组学在动脉粥样硬化疾病预测和预防中的应用

蛋白质是基因表达的产物，包括组织、器官和整个生物体的结构性成分，其介导了与新陈代谢、调节、信号转导、生长和衰老有关的大部分生物化学活动。因此，蛋白质从某种程度上代表了人类疾病的中间表型，是药物开发的常见靶标，也可以作为疾病预后和治疗分层的临床生物标志物。从动脉粥样硬化预防和预测的角度来看，炎症蛋白如C反应蛋白(CRP)和白细胞介素-6(IL-6)进入临床实践可以作为预测炎症风险，最终为血管疾病的靶向抗细胞因子治疗提供了新的参考。此外，不像多基因风险评分那样强调固有的状态和不可修改的风险标志物，基于蛋白质的风险评分至少在理论上是动态的，对环境的影响是有反应的，并且可以随着生活方式(根本性预防)以及药物干预(一级和二级预防)的改变而改变。因此，组织和体液的蛋白质组学分析，以及随之而来的蛋白质网络生物学的发展，其有潜力为人类生物学提供新的见解，特别是动脉粥样硬化(图1)

图1

从基因组到转录组再到蛋白质组的研究提示动脉粥样硬化疾病及其进展的日益增加的生物学复杂性。基因表达的过程中，编码的DNA链转录成为mRNA，并翻译成特定的蛋白质，然而这只是生物分子相互作用中第一步，随后这种作用将发生在蛋白质(包括翻译后的修饰，如磷酸化、乙酰化、糖基化和甲基化)以及蛋白质与蛋白质之间(如蛋白质-蛋白质网络相互作用)。反过来，蛋白质对细胞、组织、器官和生物体的结构和功能有不同的影响，包括细胞信号、代谢控制、生长和衰老的调节。与基因数据和相关的多基因风险评分(本质上是静态的)不同，蛋白质数据和相关的基于蛋白质的风险评分是动态的，对各种环境和行为刺激都有反应，包括生活方式的改变、锻炼和营养。因此，从基因组学转向蛋白质组学，不仅可以为晚期药物开发(二级预防，中度修饰)提供新的参考意见，也可以为早期根本性和一级预防(高度和中度修饰)提供治疗性的见解。

在过去的十年中，蛋白质组学领域中技术和生物信息学不断进步，特别是当通过各种新的预分馏技术增强时，质谱仍然是发现、综合蛋白质分析和翻译后修饰(糖基化、磷酸化、乙酰化和甲基化)检测最常用的技术。相比之下，在预防和精准医学领域，蛋白质组学已经倾向于基于亲和反应物的平台，以进行更有针对性的蛋白质评价。后一种技术的例子包括多重Elisa(酶联免疫吸附试验)阵列(Luminex，Quanterix)、基于适配体的技术(SomaScan)以及通过多重邻位延伸分析技术(Olink)检测蛋白质多种抗体标记的核苷酸。虽然这些技术对于大规模群体分析具有优势，但它们也有一定的局限性，因为它们不能用于发现未经检测系统预先指定的新蛋白质，而且存在动态范围的差异问题，由于不同抗体和适配体的结合亲和性差异，仅存在一定的跨平台相关性，迄今为止对异构体或翻译后修饰几乎没有特异性的检测方式。其他新兴的蛋白质组学平台包括那些有望通过纳米颗粒技术(SEER)或通过重复应用非常短的氨基酸序列(Nautilus)对大量的多肽进行全面检测的平台。目前，虽然这些方法具有重要的发现潜力，但其技术用途和适用于大规模人口的研究仍有待进一步证实。

在这一期的《欧洲心脏杂志》上，Nurmohamed和他的同事创造性地应用了基于olink的方法，在870名二级预防参与者的衍生队列(SMART)中，利用276个靶向血浆蛋白作为复发性血管事件的预测因子，然后在验证队列中对700名类似患者进行了测试(Athero-Express)。结果显示在相对规模上最强的蛋白质预测因子是N-末端前B型利钠肽(NT-proBNP)，数据与十年前进行的单蛋白Meta分析一致，确定了3个蛋白分别为肾损伤分子-1(KIM-1)、基质金属蛋白酶-7(MMP-7)和生长分化因子-15 (GDF-15)。令人欣慰的是，这四种蛋白质在作者之前使用类似技术对一级预防进行的蛋白质组学研究中也同样存在，尽管在其他两项研究中检测到的其他蛋白质之间的重叠不是很明显。IL-6在二级预防队列中并没有作为蛋白质预测因子出现，但在CRP升高的患者因果分析中可以作为一个预测因子。作者进一步指出，在验证队列中，基于蛋白质的模型在统计学上优于具有良好校准的基于临床的模型，这是一个非常有前瞻性的观察性实验。

不熟悉蛋白质组学的读者可能会发现Nurmohamed等人使用的机器学习技术具有挑战性，因为蛋白质组学工作通常需要生物信息相关专业知识的支持。然而，重要的是要认识到，在许多蛋白质组学平台中使用的方法和随后生成的模型不能轻易地解读关键的生物学，而且通常只允许对蛋白质风险进行相对而非绝对的报告。这样不用先进行传统的Elisa，将相对规模上发现的特定蛋白质整合到基于绝对测量水平的现有预测算法中是相当困难的(就像低密度脂蛋白胆固醇、高敏C反应蛋白和血压一样)。因此，Nurmohamed等人提供的新证据，虽然具有挑衅性，并对现有文献进行了实质性的补充，但不能轻易地使用实验室工具来构建一个新的风险评分。尽管如此，目前作者提供的一级和二级预防数据着重地扩展了使用Luminex平台中另一个一级预防队列中心脏病发生率的蛋白质组学研究的证据，以及第一代稳定冠心病患者的早期研究SomaScan寡核苷酸适配子。

除了将新蛋白质整合到现有的分数之外，其他的问题将使蛋白质组学的发现转化为临床挑战。首先，至少在现有的动脉粥样硬化研究中，除了一些相互关联的炎症蛋白，NT-proBNP和GDF-15。特别是，迄今为止几乎没有发现的蛋白质被复制。在最近的Malmo Diet和Cancer Study中，其是一项针对3918名参与者的全因死亡率的研究，对138种候选蛋白质的评估显示，只有3种蛋白质是一致的、可靠的(其中2种又是NT-proBNP和GDF-15)。此外，使用已建立的危险因素的C统计量比较模型(0.722)的变化仅增加到0.728，其中包含蛋白质组数据，虽然有统计学意义，但没有临床意义。然而，Malmo Diet数据标志着一个重要的转变，即从方便抽样转向具有高质量表型和伴随的基因组和生物标志物数据的复杂的前瞻性流行病学队列。

其次，除了需要外部验证之外，到目前为止，在不同平台上检测到的蛋白质相关性都不是最优的。在Olink和SomaScan上捕获的蛋白质之间的相关性似乎只是适中的，即使是限制在高度丰富的蛋白质上。在最近的一份比较基于适配体和抗体的蛋白质组分析的报告中，包括了871种常用评估的蛋白质，36%的报道的蛋白质-表型连接仅在两个平台中的一个出现，这种不匹配的部分原因是遗传变异改变了蛋白质氨基酸序列和选择性剪接的关系。事实上，这一分析显示了SomaScan和Olink评估对于GDF-15本身的方向性差异关联，似乎是由基因诱导的替代GDF-15“变体”引起的，这些变体被各个平台区别地检测出来。此外，在平台间共享的64%蛋白质性状中，由于技术变异、蛋白质特性、结合亲和力、样本处理和遗传变异的结合，相关性相对较低。今后，这种缺乏专一性的情况必须谨慎处理。

第三，蛋白质组学极大地放大了与生物标志物研究相关的传统流行病学问题。从古典流行病学的角度来看，一个观察到给定的生物标志物和动脉粥样硬化等疾病之间的联系可能代表一个因果，因此动脉粥样硬化可能代表了一种有因果关系的可改变的途径，但也可能是由于疾病本身或与相关危险因素(如吸烟、肥胖、或者高血压)本身并没有因果关系。在基因组学和蛋白质组学的发展背景下，蛋白质表达水平也可能是疾病本身遗传变异的结果，或可能通过与疾病完全无关的机制或通过多种不同的翻译后修饰而受到一种变异的影响。因此，蛋白质组学研究人员需要将因果关系与偶然观察区分开来。

第四，尽管生物信息学取得了很大的进展，但由于蛋白质效应的多样性与潜在的病理相关性，临床转化将是缓慢的。在最近对Framingham心脏研究中6861名参与者中选择的71种蛋白质的基因组和蛋白质组学评估，13种蛋白质被认为可能是因果关系，其中8种被发现可以预测新发心血管疾病。在一项包含30000个个体的90种蛋白质的基因组和蛋白质组数据的可比评估中，描述了11种与疾病有关的新蛋白质，这些新蛋白质有因果证据，而且研究人员在预测动脉粥样硬化的过程中也面临着多样性的问题。在一项可能是迄今为止规模最大的此类研究中，deCODE Genetics最近发表的一项研究评估了35559名冰岛人的4907个适配体，并在373个疾病中确定了25万个关联。通过这一新兴的生物学技术用于工作似乎是一项艰难的工作，在血液和其他体液的评估中，只有一小部分人类细胞分泌的蛋白质被捕获，而大量潜在的关键蛋白质被保留在细胞内。

尽管存在这些问题，目前来自Nurmohamed等人的数据。让我们为之欣喜的是，编码并反映多种健康状态风险证据的蛋白质表达模式，有一天可能会提供全面的“液体健康检查”。最近，在疾病特异性状态下整合蛋白质组学和基因组学数据的努力在冠状动脉疾病和糖尿病中都很有前景，而专注于蛋白质的孟德尔随机化研究已经成为药物开发的一部分，而且可以作为一种推断循环生物标志物潜在因果关系的方法。

因此，蛋白质组学在动脉粥样硬化和相关代谢疾病方面的研究还处于起步阶段。未来的关键问题有很多，这对心血管医学有着深远的影响。环境的相互作用和行为，如饮食、营养、锻炼和吸烟，是如何在蛋白质水平上引发和促进动脉粥样硬化的？哪些关键的细胞内和分泌的蛋白质可以作为生物标志物和治疗靶点加以利用?最终，蛋白质组学和下游代谢组学将如何解决原始、一级和二级预防的未来干预策略都将是未来的研究方向。