美国波士顿丹娜-法伯癌症研究所和麻省总医院主导的纳武单抗联合卡博替尼联合治疗转移性三阴乳腺癌（metastatic Triple-Negative Breast Cancer，mTNBC）的II期安全性和治疗效果的生物标志物研究结果，近日发表在NPJ Breast Cancer杂志上，此项前沿性探索性工作具有一些非常值得关注的亮点：
- 从基因-转录-蛋白多组学评价纳武单抗联合卡博替尼免疫治疗效果
- 传统指标PD-L1和TMB（Tumor Mutational Burden, TMB）存在局限性
- 血浆中免疫抑制性细胞因子、趋化因子和免疫检查点蛋白的高基线水平与疾病快速进展相关
- 除PD-L1以外，监测循环PD-1变化极为重要，将是PD-1抑制剂药效学评价的潜在标志物
三阴性乳腺癌（Triple-Negative Breast Cancer, TNBC）指雌激素受体 (Estrogen Receptor, ER)、孕激素受体 (Progesterone Receptor, PR)、人表皮生长因子受体-2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER-2)表达均为阴性的一类乳腺癌，约占浸润性乳腺癌病例的15-20%，TNBC在诊断后3-5年内出现复发的风险更大且5年生存率更低，属于乳腺癌的分型里较为凶险的一种。
由于缺乏靶向治疗，TNBC通常采用全身化疗治疗。最近开发转移性TNBC（mTNBC）新疗法的努力集中在直接调节和增强免疫细胞功能上，特别是PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的临床开发。然而，这些药物作为单药治疗时对mTNBC的疗效并不明显。同时，大多数TNBC患者并不适合接受免疫治疗，许多符合条件的患者并没有从中获益。
事实上，一些研究已经表明，与原发肿瘤相比，转移性乳腺癌是 "免疫学 "冷肿瘤，其表型特征是低肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和干扰素γ的明显减少，这可能是导致免疫疗法在这种情况下受益有限的原因。因此，需要采取新的治疗策略，增加效应淋巴细胞的浸润，减少肿瘤内免疫抑制，以提高免疫检查点抑制剂在mTNBC中的疗效。
在本研究中，由美国丹娜-法伯癌症研究所（Sara Tolaney）和麻省总医院（Dan Duda）团队评估了卡博替尼(Cabozantinib)联合纳武单抗(Nivolumab)对之前接受0-3线化疗的mTNBC患者的安全性和有效性。同时，还利用免疫组织化学、基因组学、转录组学和蛋白组学等多角度研究探讨了针对免疫联合治疗方案的分子介导物和生物标志物。
此项单臂II期研究调查了卡博替尼联合纳武单抗治疗转移性三阴性乳腺癌（mTNBC）的疗效和安全性。主要终点是RECIST 1.1（实体瘤的疗效评价标准）的客观缓解率（Objective Response Rate, ORR）。基线和第1周期后的活检样品针对肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocytes, TILs）、PD-L1、全外显子组和转录组测序进行了分析。只有1/18的患者获得了部分缓解（ORR 6%），试验被提前停止。毒性导致50%的患者减少卡博替尼的剂量。一名患者的肿瘤为PD-L1阳性，三名患者的TILs>10%。有应答的患者为PD-L1阴性肿瘤，肿瘤突变负担（TMB）低，但TILs高，免疫基因表达丰富。血浆免疫抑制细胞因子、趋化因子和免疫检查点分子的高治疗前水平与疾病快速进展有关。虽然这项研究没有达到其主要终点，但免疫染色、基因组和蛋白质组研究表明，在这个mTNBC队列中存在高度的肿瘤免疫抑制。
对mTNBC患者进行了一项开放标签、单臂、单中心的卡博替尼与纳武单抗的II期研究。符合条件的患者有组织学或细胞学证实的浸润性乳腺癌，并有根据RECIST 1.1可测量的转移性疾病。肿瘤必须是ER阴性和PR阴性，定义为免疫组化表达<10%，且 HER2阴性。对于有安全可及疾病的患者，必须在基线和第2周期第15-28天的治疗中进行研究活检。参与者之前可能接受了0-3线转移性乳腺癌的化疗。其他纳入标准包括年龄≥18岁，ECOG表现状态≤1。排除标准包括以前接受过MET抑制剂或免疫检查点抑制剂的治疗，以及有心血管或胃肠道肿瘤侵犯的证据。
纳武单抗 480毫克在每28天周期的第1天静脉注射，卡博替尼40毫克每天口服一次，持续28天周期。该研究的第一阶段包括联合方案的安全磨合。如果前六名入组患者中≥2名出现剂量限制性毒性，试验将关闭，不再继续入组。在筛选时和第2周期的第15-28天进行活检。每次活检的组织都被用于探索性的生物标志物研究。此外，在基线、第2周期的第1天和随后的每个周期、每个再分期访问以及疾病进展的停药期，都收集了每位患者的研究血样。
根据RECIST 1.1，主要终点是ORR。该研究遵循西蒙的最佳两阶段设计。在第一阶段，有18名患者入选。如果至少有3/18的患者达到完全或部分反应，那么将再招募17名患者。如果至少有7/35名患者达到完全反应或部分反应，那么联合治疗方案将被认为值得进一步研究。基于这种设计，10%或更少的真实ORR将不具有临床意义，是无效假设，而30%的真实ORR将被认为是有临床意义的反应水平。样本量有90%的把握度可以宣布组合在这个比率上有效，在无效假设下，单侧I型错误率为5%。次要目标包括CBR，定义为在第24周完全缓解、部分缓解或疾病稳定的患者比例，PFS，以及不良事件频率。
研究探讨了PD-L1状态、TILs和肿瘤突变负担（TMB）与结果的关系。共有17名（94%）患者通过使用SP142抗体的VENTANA检测法进行了PD-L1检测评估。PD-L1阳性被定义为PD-L1染色的免疫细胞（IC）≥肿瘤面积的1%。此外，16名（89%）患者有苏木精和伊红染色的切片，可根据国际TILs工作组指南评估基质TILs。
共有14名（78%）患者使用下一代测序板OncoPanel进行了基因组分析，并根据这些结果评估了TMB。OncoPanel使用靶向外显子测序技术，利用肿瘤来源的DNA检测整个编码区和预定义的癌症相关基因子集内的拷贝数改变、单核苷酸变异和转座。
评估整个治疗过程中肿瘤免疫微环境的免疫蛋白基因组学变化。使用Olink Target 96蛋白组学研究平台，对所有18名患者的基线和治疗中的血浆样本进行了110种循环血管生成蛋白和炎症蛋白及其与联合疗法反应的相关性评估。在这个蛋白质组学数据的探索性分析中，未对显著性测试进行多重假设的修正。同时，对患者进行了基线和治疗中的样本（肿瘤活检以及血浆）的全外显子组和转录组测序。
从2017年12月15日至2019年1月24日，18名患者被纳入第一阶段的试验。中位年龄为58岁（范围为41-71岁），所有患者的ECOG表现状态为0。最常见的转移性疾病部位为淋巴结（61%）、骨（44%）、肝（39%）和胸壁（39%）。之前对MTNBC进行的细胞毒性疗法的中位数是1（范围0-3）。共有16名（83%）患者的肿瘤的ER表达为0，2名患者的肿瘤的ER表达<10%。
18名患者中只有一名患者有部分缓解（ORR 6%，95%CI：0-27）；因此，该研究不符合进入第二阶段试验的预设标准，并停止进一步招募。14名患者（78%）病情稳定，2名（11%）病情进展为最佳反应。临床获益率为17%（95%CI：4-41%）。中位PFS为3.6个月（95%CI：1.9-6.9）。单个部分响应的患者有持续的持久反应，持续时间超过2年。
卡博替尼与纳武单抗的联合治疗没有任何意外的不良事件。100%的患者发生任何等级的全因不良事件，而83%的患者发生3-4级不良事件。
在15名患者（8名原发性和7名转移性样本）中成功评估了PD-L1。只有一名患者的肿瘤为PD-L1阳性。16名患者（5名原发性和11名转移性样本）的TILs被成功评估。原发性样本的TIL水平中位数为10%（范围1-50），转移性样本为5%（范围1-50）。
在接受靶向小组测序的14名患者（78%）中，没有体细胞核苷酸变异或拷贝数改变与PFS有关。肿瘤和血浆样本的全外显子组测序显示了与靶向组测序类似的结果，没有明显与PFS相关的改变。在同一时间点，血液活检与组织活检相比，显示出更多的改变，这与之前的研究发现血液活检能更好地捕捉多个部位的肿瘤异质性相一致。
基因组富集分析显示，部分反应患者的基线和治疗中的肿瘤活检中免疫蛋白基因组表达较高，特别是异体移植排斥、TNF-α、炎症反应、IL-6/JAK/STAT3信号传导和干扰素γ（IFN-γ）反应途径的癌症标志物。
对转移性TNBC的组织进行基因组和转录组分析，以检测与纳武单抗与卡博替尼治疗后的持久反应的关联
“同时，利用Olink蛋白组学研究平台，血样被进一步用于评估血管生成和炎症分子的循环水平，这些分子以前被确定为TNBC中抗VEGF治疗反应的相关因素。有趣的是，免疫联合治疗与所有患者的血浆PD-1浓度大幅和持续增加有关，但PD-L1水平没有变化。此外，治疗与血浆CA-IX、IFN-γ、CRTAM、ADA、CXCL9、CXCL10、GZMH、FASL和HO-1的增加有关，血浆IL-12和TNFRSF12A减少，但不影响血浆PD-L1。多个标志物的高基线血浆水平，包括生长因子（VEGF-A、HGF、PlGF和ANG2）、趋化因子（CX3CL1、MCP1、MCP2、MCP3、MCP4、CCL4、CCL19、CXCL9和CXCL10）、细胞因子（IL-5、IL-6、IL-10和TNF-α）和免疫检查点分子（LAG3、CD27和CD70）都与较短的PFS有关。较长的PFS仅与基线和第2周期之间循环sVEGFR2和TNFRSF12A水平的较大下降有关。”
正如抗VEGFR2酪氨酸激酶抑制剂所预期的那样，治疗与血浆VEGF和PlGF的增加以及sVEGFR2浓度的下降有关，进一步验证了研究人员在2017年报道的一项卡博替尼单药用于MTNBC的II期试验结果 (Tolaney et al. Oncologist 22, 25–32. 2017):
本研究系统评估了多激酶抑制剂卡博替尼与抗PD-1抗体（纳武单抗）联合治疗mTNBC患者的疗效和安全性。该研究的第一阶段在18名患者中产生了6%的ORR，该研究不符合进入第二阶段的标准，因此提前结束。卡博替尼与PD-1阻断的组合不足以激活所有患者的抗肿瘤免疫力。这种联合治疗方案观察到的益处不足，可能是由于卡博替尼在这一人群中受到安全性和耐受性影响。
肿瘤学分子水平研究分析进一步表明，缺乏观察到的益处可能与研究人群中高度的肿瘤免疫抑制有关。血浆蛋白质组学研究进一步强调了本研究人群中免疫抑制的深刻程度，免疫抑制性细胞因子、趋化因子和免疫检查点的高血浆水平与疾病的快速发展相关联。最后，免疫联合治疗与血浆PD-1的大量增加有关，这需要进一步研究评估其作为这种联合治疗的潜在药效学标志物的可行性。
1.Barroso-Sousa, R., Keenan, T.E., Li, T. et al. Nivolumab in combination with cabozantinib for metastatic triple-negative breast cancer: a phase II and biomarker study. NPJ Breast Cancer 7, 110 (2021). https://doi.org/10.1038/s41523-021-00287-9
