【Alzheimer Dement】叶玉如院士借助Olink发现19-plex血浆蛋白组panel，可更准确地筛查并分期阿尔茨海默症
《Alzheimer’s Dement》：基于Olink的大规模血浆蛋白质组学分析发现并确定了用于阿尔茨海默症筛查和分期的高性能生物标志物组合
同时使用多种生物标志物来确定疾病状态，通常被称为“生物标志物组合”，是一种充分利用蛋白标志物的有效方法。在这项研究中，研究者通过使用Olink PEA技术对筛选和验证AD队列样本中的1160种血浆蛋白进行了分析（是迄今为止最全面的AD血浆蛋白质组研究），从而系统地研究了AD的血浆蛋白质组。
研究者鉴定出19种与AD相关的血浆核心蛋白标志物，并据此开发了生物标志物模型，可准确对AD进行鉴定并确定AD患者的疾病严重程度。与现有的用于AD分类的血液生物标志物（如血浆ATN生物标志物，血浆p-tau181和p-tau217等）相比，该研究鉴定出的19蛋白标志物组合准确性更高，AUC可达 0.98，且其中7个蛋白与AD发展阶段相关，可用于AD疾病分期。
目前，临床上评估阿尔茨海默氏病（AD）主要采用“ATN”生物标志物：淀粉样β（Aβ）沉积（“A”），神经原纤维触角蛋白（病理性Tau，“T”）和神经衰退（“N”），然而其需要进行侵害性脑脊液采样以进行蛋白质测量和通过断层扫描（PET）进行昂贵的成像，极大地限制了其在人群规模筛查AD中的应用。
最近发现的基于血液的AD生物标志物（即血浆Aβ42/40 比率、tau/磷酸化tau[p-tau]和神经丝轻多肽 [NfL]）提高了 AD的替代性、侵入性较小的基于血液检测的可能性。特别是血浆 p-tau181 和p-tau217可以较准确地对AD进行分类，并与AD特定的脑部病变（包括tau磷酸化和Aβ沉积）相关。此外，横断面和纵向研究表明血浆p-tau和NfL可以指示疾病进展。尽管如此，由于它们在AD进展过程中相对恒定，这些血液生物标志物可能没法区分AD不同阶段。此外，尽管一些先导筛查研究确定了一些与AD相关，具有预测价值的血液蛋白标志物，但目前尚不清楚现有的研究是否能够充分反应AD血液蛋白质组的完整特征。因此，需要全面的蛋白组分析以阐明AD血液的蛋白质特征并描述疾病的途径和阶段。
基于Olink超灵敏和高通量蛋白质测量技术的最新进展使得对血液进行大规模蛋白质组学分析，从而鉴定出新的生物标志物成为可能。在这项研究中，研究者使用了Olink的邻近延伸分析（PEA）技术来系统地评估AD血浆的蛋白质图谱。具体而言，在香港的中国AD队列（以下简称“发现队列”）中，由106位AD患者和74位健康对照（HC）组成，并且都含有他们的人口统计学数据，认知指标，脑区域容量和血浆AD生物标志物水平（即，Aβ42/ 40比值，tau，p-tau181和NfL）可用。
基于Olink技术，研究者对发现队列每个样本中的1160种血浆蛋白进行了定量检测，并揭示了429种血浆蛋白在AD患者中具有显著性变化。研究者进一步选择了19种代表性“枢纽蛋白”，组合成一个AD评分系统，该评分系统可以准确地鉴定临床AD（曲线下面积AUC=0.9690-0.9816）和相关的内表型，并在独立队列中进行了验证。此外，研究者还揭示了某些血浆生物标志物蛋白在AD的特定阶段有显著差异。因此，通过该研究，研究者确定了AD血浆蛋白质组的综合概况，并建立了针对AD的高性能血浆生物标志物组合，这为开发基于血液的AD筛查和分期测试奠定了至关重要的基础。
血浆Aβ42/40比率，tau水平和NfL水平（统称为血浆ATN生物标志物）是AD患者血液中发生变化的最知名蛋白标志物。因此，研究者首先使用SIMOA数字生物标记物检测平台在发现队列中测量了ATN的水平。
与先前欧洲人群队列研究发现一致，发现队列人群中AD患者的血浆Aβ42/ 40比值较低，血浆NfL水平高于HCs（P <0.001，图2A，C），而血浆 tau 水平在各组之间没有显着差异（P = 0.830，图 2B）。这些结果表明，血浆ATN生物标志物在中国AD患者中表现出一致的变化。
随后，研究者使用Olink PEA技术鉴定了哪些血浆蛋白在AD中差异表达。在1160种经测定的血浆蛋白中，发现共有429种在AD患者中差异表达，其中包括61种显著上调的蛋白和368种显著下调的蛋白（FDR调整后的P <0.05；图3A，B）。随后，研究者使用ELISA和SIMOA平台对基于PEA鉴定出的CASP-3，CD8A和NfL进行了交叉验证（图4）。此外，荟萃分析显示，在既往欧洲人群研究中已报告了429种与AD相关的血浆蛋白中的77种，其中56种在AD患者中一直发生变化。
具体来说，为了检查在不同人种人群中是否可以观察到一致的变化，研究者将基于香港市民的结果与瑞典轻度认知障碍 (MCI) 队列中的蛋白质组学结果进行了比较（即（BioFINDER），使用相同Olink技术在早期AD患者中测定了270种血浆蛋白）。两项研究中同时检测到的大多数血浆蛋白均显示出相似的趋势（最大r2 = 0.31，P <0.0001；图5B）。
对本文确定的与AD相关的血浆蛋白的进一步检查显示，两个队列中蛋白水平的变化之间具有更强的相关性（最大r2 = 0.49，P <0.0001；图5C）。综上所述，这些结果支持本文鉴定的与AD相关的血浆蛋白在不同蛋白质检测平台，不同种族和疾病阶段之间是高度可再现的。
2. 19种蛋白生物标志物组合可代表整个AD血浆蛋白质组
共表达网络分析或GO分析可以将许多功能相关的血浆蛋白分类为簇或途径，从而能够选择代表整个血浆蛋白质组的蛋白子集。研究者因此进行了相关网络分析，检查了429种AD相关血浆蛋白的整合模式，然后对所得相关矩阵进行了层次聚集聚类分析。结果共产生了19个与AD相关的血浆蛋白簇（图6A），每个簇都与独特的生物学过程和独特的细胞类型表达谱相关。研究者随后选择了与AD关联最紧密的蛋白标志物作为19个簇中的“中心”代表性蛋白标志物。
值得注意的是，这19种中心蛋白标志物与血浆ATN生物标志物的相关性分析显示，其中有10种蛋白标志物与Aβ42/ 40比率，tau水平或NfL水平相关，而其余9种蛋白与它们中的任何一种都不相关（图6C）。因此，研究者确定了19个血浆中心蛋白标志物，它们可同时捕获AD血浆蛋白质组中的ATN依赖性和ATN非依赖性变化，并代表AD患者的整体血浆蛋白质组学特征。
3. 由19种中心蛋白生物标志物建立的整合模型可准确区分AD
血浆ATN生物标志物是AD分类中表征最充分，研究最广泛的血液蛋白候选物。在发现队列中，基于血浆ATN生物标志物AD分类的最大准确性为87.35％（图7A，B）。鉴于上述19种中心蛋白标志物在AD血浆中一直发生变化，且与患者的年龄，性别，AD药物使用或载脂蛋白E（APOE）ε4基因型无关，因此研究者检查了它们是否也可用于对 AD 进行分类。
研究者根据19种核心蛋白的水平建立了AD分类的综合模型，应用该模型为每个个体生成AD分类评分，结果表明该模型在区分AD患者与HC的性能上优于血浆ATN生物标志物的模型，AUC高达0.9816（图7A–C），可以准确区分AD患者和HC。此外，将这三种血浆ATN生物标志物整合到19蛋白模型中并不能提高AD分类的准确性，这与之前的结果一致的，即19蛋白组合可捕获AD血浆中ATN依赖性和ATN非依赖性变化（图7D）。
有趣的是，19种血浆核心蛋白中有7种与认知能力显著相关，表明在AD进展中可能发挥作用。相应地，19蛋白模型的分类准确性与AD患者的MoCA评分相关。因此，研究者随后检查了19蛋白模型预测与AD相关的内表型能力。结果显示，大多数HC的AD分类评分均低于0.3，而AD患者的AD分类评分均高于0.8（图7C）。因此，研究者将得分<0.3、0.3-0.8或> 0.8的个体分别分类为正常，轻度AD和重度AD。该模型评分分级的严重程度与认知能力（图7D）以及海马体积的减少（图7E）和灰质体积（图7F）密切相关。
此外，被分类为患有严重AD的个体表现出升高的白细胞计数（图7G），表明炎症更为明显。综上所述，这些结果表明基于19种蛋白质生物标志物组合的整合模型不仅可以准确地区分AD患者和HCs，还可以反映与AD相关的内表型。因此，该模型可以作为开发个性化，高性能AD筛选和监控策略的基础。
4. 在独立队列中验证19个蛋白生物标志物组合
接下来，为了验证该19个蛋白生物标志物组合是否可用于AD筛查，研究者在独立的“验证队列”中测量了19种核心蛋白的血浆浓度（图8A）。其中6种蛋白质：KLK4（图8B），LIF-R（图8C），CASP-3（图8D），NELL1（图8E），CD164（图8F）和LYN（图8G）经过交叉验证，在验证队列AD患者中表现出与在发现队列中观察到的一致显著改变。此外，还有10种其他核心蛋白表现出与发现队列的变化一致趋势。
将基于19种核心蛋白标志物血浆水平的整合模型应用于验证队列可得到同样高度准确的AD分类结果（AUC = 0.9690），且再次比血浆ATN生物标记物的模型（AUC = 0.8871）更准确（图8H）。此外，研究者再次验证，该模型生成的AD分类分数与认知能力相关（图8I，J）。因此，这些发现证实了该整合模型能够准确反映与AD相关的内表型。
最后，对两个独立队列的综合分析显示，整合模型可准确地对AD进行分类，敏感性为90.51％，特异性为90.91％（AUC=0.9594）。所得的AD分类评分和指定的AD严重程度级别也能将HC患者与AD患者区分开，并准确反映出认知能力下降。因此，这些发现共同证明了此基于19个蛋白质生物标志物组合的整合模型可以对AD和相关的内表型进行准确分类。
5. 19种蛋白生物标志物组可准确区分AD-tau病理学进展
与血浆ATN生物标志物相比，血浆p-tau181是一种更准确，更特异的AD血液生物标志物，可以表明脑中tau病理的进展。一致地，在我们两个独立的队列中，AD患者的血浆p-tau181水平均升高（图9A），与血浆ATN生物标记物相比，其能更为准确地对AD相关内表型进行分类。
因此，研究者随后研究了使用血浆p-tau181作为AD-tau病理指标下，19蛋白标志物模型预测p-tau状态的性能。研究者根据血浆p-tau181水平将队列分为p-tau181阴性或p-tau181阳性组，根据Youden指数得出的cutoff值为2.55 pg/mL。结果显示，19种蛋白标志物模型确定的AD严重程度水平与p-tau181状态显著相关：严重组中≈80％的个体为p-tau181阳性，而正常组中为≈20％（图9C）。
此外，由于p-tau181状态与认知表现，脑区域容量和血浆ATN生物标志物方面相比，能更准确地对AD进行分类。因此，研究者在发现和验证队列中均观察到了p-tau181阳性AD中19种血浆核心蛋白的变化更显著。具体而言，19蛋白标志物物模型可准确地区分p-tau181阳性AD患者和p-tau阴性HCs，在发现队列中AUC可达 0.9881，在验证队列中AUC达0.9863，在组合队列中AUC达=0.9844（图9D）。
因此，这些结果共同证明该19蛋白模型对tau病理分类的AD具有特别高的准确性，为开发针对AD的高度特异性的基于血液的诊断工具提供了基础。
6. AD中血浆核心蛋白标志物的阶段依赖性失调
AD的进展可以通过与AD相关的内表型（例如认知表现）和生物标志物水平（例如血浆p-tau181）来标记。但是由于缺乏阶段特异性的生物标志物，AD的各个阶段缺乏明确的生物学定义。本研究中的19个蛋白标志物组合中有10个与血浆p-tau181水平相关，此外还有7个也与认知（即MoCA）评分相关。
进一步研究揭示了这些血浆核心蛋白在认知能力下降和tau病理学发展过程中的变化趋势（图10）。
首先，三种核心蛋白标志物，NELL1和hK14（在脑中表达）和CETN2（在脑和周围神经系统中表达），在AD早期失调（即MoCA评分>25，血浆p-tau181水平<2.5 pg/mL），并且在疾病的整个进展过程中持续变化。
其次，LYN，PRKCQ和LIF-R的血浆水平仅在早期和/或中期发生改变（MoCA评分：10–25），在后期相对保持恒定。最后，由外周巨噬细胞表达的KLK4仅在AD晚期失调，此时个体存在严重的认知缺陷（即MoCA评分<15）和tau病理（血浆p-tau181水平>4 pg/mL）。
这结果表明某些血浆蛋白的变化（或生物学过程）与AD的特定阶段有关。因此，这些结果表明，本文鉴定的血浆核心蛋白不仅可以将AD患者与HCs准确地区分，而且更重要的是检测个体血液中这些血浆核心蛋白标志物水平的变化也许可以推断其AD发展阶段，为AD分期提供生物学注释。
结论：
同时使用多种生物标志物来确定疾病状态，通常被称为“生物标志物组合”，是一种充分利用蛋白标志物的有效方法。在这项研究中，研究者通过使用Olink PEA技术对筛选和验证AD队列样本中的1160种血浆蛋白进行了分析（是迄今为止最全面的AD血浆蛋白质组研究），从而系统地研究了AD的血浆蛋白质组。
结果表明，研究者鉴定出19种与AD相关的血浆核心蛋白标志物，并据此开发了生物标志物模型，可准确对AD进行鉴定并确定AD患者的疾病严重程度。与现有的用于AD分类的血液生物标志物（如血浆ATN生物标志物，血浆p-tau181和p-tau217等）相比，该研究鉴定出的19蛋白标志物组合准确性更高，AUC可达 0.98，且其中7个蛋白与AD发展阶段相关，可用于AD疾病分期。
总之，该研究不仅为开发可用于临床环境中AD筛查和监测液体活检技术奠定了基础，还为将来的治疗方案开发提供了丰富的蛋白质靶标。
