非标样本准备要求—细胞组织裂解

对血清和血浆样本，Olink 进行了充分的优化与验证，故不再需要预实验。

除此之外的其他样本类型（非标样本），蛋白质组成及含量参差不同，进行预实验可以确保在最佳条件下分析样本，保障检测指标在有效的动态及线性范围内，以及排除有可能存在的过饱和风险。因此我们强烈建议非标样本都需进行预实验。

裂解组织样品

一般来说，组织裂解液的制备需要额外的机械方法（如均质器、打珠、超声）来实现完全的细胞裂解。

一般经验：组织与裂解液的比例应在1:20-1:50的范围内，以（克/毫升）为单位。例如：一个10毫克的组织应在200微升至500微升的裂解缓冲液中进行裂解。

（注意：具体请遵循对应产品说明书的指示。）

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• 从最低的推荐体积开始准备，以避免将蛋白浓度稀释到Olink推荐浓度以下。
• 如果浓度过高，则用裂解缓冲液进一步稀释。
• 最后分装40ul细胞/组织裂解液于96孔板（带封膜），保存于-80°C，干冰运输。

（注意：密封，并用永久性标记笔（防酒精/褪色）标记管子）

归一化样品中的蛋白质浓度

建议先处理少量样品，用以检查蛋白浓度是否在Olink推荐的分析范围内（0.5mg-1mg蛋白/ml=0.5μg-1μg蛋白质/μl）。若不在范围内时，可通过调整细胞和组织用量或裂解液的体积来达到这个浓度。例如，你可以使用更多的裂解缓冲液将浓缩的样品稀释到Olink推荐的蛋白浓度（0.5 mg-1 mg/ml）。并对样品进行归一化处理， 使它们都具有相同的蛋白质浓度。

关于裂解不完全的建议

• 如果在减少裂解缓冲液的体积时遇到了细胞裂解不完全的情况（例如，裂解液中可能有碎   片和组织片），加入机械裂解方法（例如，超声处理、打珠、均质化等）将有助于完全裂解细胞。
• 超声处理是制备细胞/组织裂解液的一种常用方法。超声处理程序通常是根据你的细胞类型、数量、大小、来源和特性来设计的。也可以使用其他的机械破坏方法，并确保所用方案的一致性。

提示：

1. 一定冰上超声处理细胞！！！低振幅和长超声处理比高振幅和短超声处理好。  建议这样做是为了避免样品加热和引入蛋白质的变性效应。

2. 使用10-40%的振幅和10秒-1分钟的超声处理时间。在选择脉冲开/关时使用相同的时  间（例如，10秒脉冲开，然后10秒脉冲关）。选择短的细胞裂解时间是为了在有裂解缓冲液的情况下加强细胞裂解。

3. 裂解液预处理的质量可以在SDS聚丙烯酰胺凝胶上检验。 弥散的凝胶/平面和奇怪的条带可能是蛋白质降解或细胞裂解液制备不当的迹象。

4. 如果你选择了一个实验程序，请使用这个程序来制备你的所有样品，以避免在你的   样品制备中引入不可控因素。

细胞/组织：不同组织(如心脏、大脑、肌肉) 和不同细胞系 (如稳定细胞系、原代培养、不同培养条件) 的裂解液浓度需要调整至总蛋白浓度 0.5-1 mg/mL（即每个裂解液样本最终浓度保持一致。 Lowry， Bradford， BCA，Nanodrop浓度测定方法都可。注：需控制的是细胞/组织裂解物的浓度并非提取的蛋白浓度）

注意: 组织样本都应该是新鲜冷冻，福尔马林处理的样本不适用。

兼容裂解液

1. 细胞裂解液

NP40裂解缓冲液：最终浓度:(Nonidet P40 1%， Triton X-100 0.1%，磺基甜菜碱0.1%，NaCl 150 mM, 1X罗氏蛋白酶抑制剂(cat 11836153001)，1X Tris-EDTA缓冲液pH 8.0)。

Bio-Plex细胞裂解缓冲液(cat 171-304011,Bio-Rad)：使用前加入以下缓冲液: +因子1和2(来自试剂盒)+罗氏蛋白酶抑制剂鸡尾酒(cat 11 836153001)。

M-PER哺乳动物蛋白提取试剂

2. 组织裂解液

RIPA组织裂解液：1X缓冲液:50 mM Tris-HCl pH7.4, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% sodium deoxycholate。  

添加蛋白酶抑制剂到新鲜的1x缓冲液：1 mM PMSF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(最终浓度 10.4 mM AEBSF, 8 μM Aprotinin, 0.2 mM Leupeptin, 0.4 mM Bestatin, 0.15 mM Pepstatin, 0.14 mM E-64)。

3. 其他兼容裂解液

• 市售RIPA缓冲液：(10X) Millipore; cat # 20-188(0.25%脱氧胆酸盐)
• T-PER组织裂解液

不兼容的裂解液

RIPA缓冲 (10X) Sigma; cat # R0278(1%脱氧胆酸盐)

应避免的成分

普通洗涤剂浓度过高(最大量1%的triton, NP-40或tween)

离子去污剂(最高浓度~0.1%SDS或脱氧胆酸盐)

大量高或低pH值的缓冲溶液(pH值应在生理水平附近)

高水平EDTA(保持<~25mM)

变性组分

还原成分含量过高(例如:保持DTT < 1mM)

高盐浓度，保证以下浓度:

<~250 mM NaCL

<25 mM KCl

<10 mM MgCl